CRISPR/CAS是什么？

CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）。II型原核生物CRISPR“免疫系統(tǒng)”的發(fā)現(xiàn)，使得能夠開發(fā)簡(jiǎn)單、易用、快速實(shí)施的RNA指導(dǎo)的基因組編輯工具。CRISPR首字母縮寫通常發(fā)音為“ crisper”。

CRISPR / CAS采用何種工作原理？

CRISPR通路在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，其功能很像免疫系統(tǒng)，可以抵御入侵的病毒和質(zhì)粒DNA。來自入侵病毒的短DNA序列（間隔區(qū)）摻入細(xì)菌基因組內(nèi)的CRISPR基因位點(diǎn)，并充當(dāng)先前感染的“記憶”。再感染引發(fā)互補(bǔ)的成熟CRISPR RNA（crRNA）以找到匹配序列 — 其為CRISPR相關(guān)（Cas）核酸酶提供特異性，以在特定 “外源” DNA序列處形成雙鏈斷裂。

圖 1.基因組靶標(biāo)位點(diǎn)
CRISPR CAS9采用何種工作原理？
為了創(chuàng)建這樣的工具，內(nèi)源CRISPR途徑被簡(jiǎn)化為兩個(gè)主要組分：Cas9核酸酶和指導(dǎo)RNA（gRNA）1-7。導(dǎo)向RNA是由crRNA和tracrRNA組成的雙組分系統(tǒng)。crRNA靶向待切割的雙鏈DNA，并且具有短的同源區(qū)域，允許其結(jié)合tracrRNA。 tracrRNA提供與Cas9蛋白結(jié)合的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。crRNA:tracrRNA雙鏈體被稱為gRNA。 Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白（RNP），可以在整個(gè)基因組環(huán)境中結(jié)合并切割特定的DNA靶標(biāo)。為了被RNP切割，靶必須具有兩個(gè)特定序列。首先，gRNA需要17-21個(gè)堿基的RNA至DNA同源性，這被稱為前間隔序列。 其次，Cas9蛋白需要有一個(gè)短的前間隔序列鄰近基序（PAM），以結(jié)合靶DNA（參見圖2）。 如果存在連接tracrRNA，并且在gRNA和基因組靶標(biāo)之間存在足夠的同源性，則RNP切割靶DNA的兩條鏈，在基因組中的該位置處產(chǎn)生DSB。

圖 2.CRISPR / Cas靶向雙鏈斷裂的示意圖。

雖然細(xì)胞核中的功能性CRISPR是RNP形式，但作為分子工具的CRISPR的組件適合于各種遞送方法。 早期實(shí)驗(yàn)成功地創(chuàng)建了嵌合單指導(dǎo)RNA或sgRNA，其將crRNA和tracrRNA組合成單個(gè)RNA鏈而不是天然存在的雙鏈體。 該sgRNA和Cas9 mRNA可以從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)，用于直接轉(zhuǎn)染或包裝成用于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的顆粒。 也可將重組Cas9蛋白與合成產(chǎn)生的crRNA和tracrRNA組合，以生成RNP轉(zhuǎn)染或顯微注射給胚胎。

靶向DSB形成后，細(xì)胞通常使用兩種DNA修復(fù)途徑中的一種來存活：非同源末端連接（NHEJ）或同源依賴性修復(fù)（HDR）。這些修復(fù)機(jī)制經(jīng)常會(huì)出錯(cuò)，導(dǎo)致在靶位置誘變，或者通過破壞編碼序列來功能性地失活或敲除基因（NHEJ），或者通過添加新的DNA序列來敲入特定的序列變化（HDR）。通過這種方式，CRISPR / Cas9系統(tǒng)能夠?qū)θ旧wDNA進(jìn)行的、可遺傳的修飾。此外，當(dāng)Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域失活并附著于其他效應(yīng)分子以作用于基因組中的gRNA指定位點(diǎn)時(shí)，CRISPR系統(tǒng)可用作靶向遞送系統(tǒng)。 這將CRISPR系統(tǒng)功能擴(kuò)展到基因激活和抑制。zui后，CRISPR系統(tǒng)可用于篩選。CRISPR / Cas9系統(tǒng)的基因敲除、基因敲入、基因激活或抑制、以及篩選這四種主要用途將在下面進(jìn)一步討論。

基因敲除

當(dāng)與靶向基因特異的gRNA一起共表達(dá)時(shí)，CRISPR / Cas9產(chǎn)生敲除細(xì)胞或動(dòng)物模型。基因敲除的目的是通過破壞其在細(xì)胞中的表達(dá)來揭示基因功能。共表達(dá)的適當(dāng)設(shè)計(jì)的gRNA指導(dǎo)Cas9切割靶序列，并在目的基因中產(chǎn)生DSB。然后可以通過三種方式中的任何一種實(shí)現(xiàn)基因敲除：1）細(xì)胞通過NHEJ修復(fù)斷裂，導(dǎo)致切割基因的開放閱讀框（ORF）內(nèi)的隨機(jī)插入或缺失（“插入缺失”）；2）細(xì)胞通過HDR從用戶提供的模板修復(fù)斷裂，將特定的破壞性序列插入ORF中；3）一對(duì)gRNA產(chǎn)生兩個(gè)DSB，其位于基本編碼序列的側(cè)翼，導(dǎo)致其切除。

NHEJ是zui活躍的修復(fù)機(jī)制，但是容易出錯(cuò)，并且經(jīng)常引入移碼，導(dǎo)致過早終止密碼子和/或?qū)е滤棉D(zhuǎn)錄物成為無義介導(dǎo)的衰變（NMD）的靶標(biāo)。移碼修飾可導(dǎo)致過早終止密碼子被引入轉(zhuǎn)錄物，阻止氨基酸鏈的關(guān)鍵部分被翻譯，導(dǎo)致異常短的無功能蛋白質(zhì)。無義介導(dǎo)的衰變通過消除含有過早終止密碼子的mRNA轉(zhuǎn)錄物來減少基因表達(dá)中的錯(cuò)誤。 理論上，當(dāng)外顯子-外顯子連接復(fù)合物（也就是RNA剪接期間在外顯子之間的前mRNA鏈上形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物）在轉(zhuǎn)錄物被剪接后未被核糖體適當(dāng)?shù)厝コ龝r(shí)，這個(gè)監(jiān)視途徑被激活。當(dāng)外顯子-外顯子連接復(fù)合物由于上游移碼而保持結(jié)合時(shí)，轉(zhuǎn)錄物被指示降解，并且功能蛋白質(zhì)從未被翻譯。這兩種途徑都有效破壞細(xì)胞中的基因功能。

基因敲入

CRISPR / Cas9也可用于引入或“敲入”新的DNA序列。常見的修飾包括引入單核苷酸多態(tài)性（SNP）、小標(biāo)簽、loxP或更大的基因盒，例如熒光蛋白。這些修飾是通過特定位置的Cas9誘導(dǎo)的DSB進(jìn)行的，這顯著增強(qiáng)了靶向整合的機(jī)會(huì)。靶向整合（基因敲入）通過HDR發(fā)生。為了通過HDR進(jìn)行基因編輯，必須將含有所需序列的DNA “供體” 或修復(fù)模板與gRNA和Cas9一起遞送至細(xì)胞，通常在供體質(zhì)粒或寡核苷酸上。基因敲入的效率通常低于敲除（<10％的修飾等位基因），但可用于產(chǎn)生范圍從單核苷酸變化至大插入物的特定修飾。

基因激活和抑制

除了作為基因組編輯工具之外，CRISPR還可以用作其他功能蛋白的靶向遞送系統(tǒng)。Cas9的一個(gè)獨(dú)特特征是它能夠獨(dú)立于DNA切割而結(jié)合靶DNA，因?yàn)檫@是Cas9機(jī)制的兩個(gè)獨(dú)立步驟。野生型Cas9具有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：RuvC和HNH。為了在沒有切割的情況下實(shí)現(xiàn)結(jié)合，通過誘導(dǎo)點(diǎn)突變（SpCas9中的D10A和H840A）使兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域失活，導(dǎo)致核酸酶死亡的Cas9（dCas9）。當(dāng)與靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的gRNA組合時(shí)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的dCas9足以通過阻斷轉(zhuǎn)錄起始來降低或抑制轉(zhuǎn)錄。在這一發(fā)展之后，科學(xué)家開始嘗試將轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子與dCas9聯(lián)系起來。KRAB轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域已經(jīng)與dCas9融合，作為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默的模式。dCas9也與轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)蛋白融合。用于激活的dCas9是廣泛流行的研究領(lǐng)域，并且包括諸如dCas9-VP64、dCas9_SunTag、dCas9-SAM、dCas9-RNA支架和dCas9-VPR的系統(tǒng)。 在我們的產(chǎn)品線中，我們將dCas9與人E1A相關(guān)蛋白P300的催化組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）核心結(jié)構(gòu)域融合。當(dāng)與靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和增強(qiáng)子區(qū)域的gRNA組合時(shí)，dCas9-P300指導(dǎo)組蛋白乙酰化，從其異染色狀態(tài)釋放DNA，以通過天然染色體環(huán)境中的內(nèi)源細(xì)胞機(jī)制上調(diào)基因表達(dá)。dCas9-P300組蛋白乙酰化方法代表了相對(duì)于dCas9-VP64或其他類似基因活化基序的獨(dú)特作用機(jī)制。

篩選

篩選可以快速調(diào)查大量候選基因或基因組位點(diǎn)，以參與您的途徑或感興趣的表型。池化寡核苷酸生產(chǎn)和大數(shù)據(jù)處理的改進(jìn)，加上慢病毒遞送的效率，使研究人員能夠同時(shí)考慮數(shù)千個(gè)候選基因，無論是作為文庫還是更為集中的子集（panel）。我們將文庫定義為CRISPR克隆的全部基因組集合；而子集（panel）則是較小的基因子集。通常，子集（panel）和文庫可以以兩種形式組裝：池化（在一個(gè)管中有數(shù)千個(gè)gRNA）或排列（在96孔板中每個(gè)孔一個(gè)gRNA）。這兩種方法都能快速地為更大的問題提供答案，與過去的方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，過去的老方法需要一次一個(gè)地詢問候選基因，是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程。

我們提供多種篩選解決方案，包括來自Broad的池化GeCKO文庫，以及Sanger陣列全基因組慢病毒CRISPR文庫，以執(zhí)行大型基因敲除篩選（8）。并且，人類和小鼠CRISPR / Cas9協(xié)同激活調(diào)控子（SAM）池化文庫亦即將推出，用于全基因組篩選轉(zhuǎn)錄激活表型！

上海峰志儀器有限公司提供便攜式熒光蛋白激發(fā)光源LUYOR-3415RG，能夠快速篩選熒光蛋白在愈傷、種子、葉片上的表達(dá)。現(xiàn)貨供應(yīng)美國(guó)路陽、美國(guó)nightsea便攜式熒光光源，能夠篩選綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等多種熒光蛋白的表達(dá)。

CRISPR / CAS9是什么？

CRISPR / Cas9系統(tǒng)于1993年被發(fā)現(xiàn)，并且顯示在細(xì)菌和古細(xì)菌生物體內(nèi)進(jìn)化，作為對(duì)病毒和外來質(zhì)粒的防御。天然CRISPR途徑的功能是將核酸酶靶向侵入性DNA，產(chǎn)生潛在致命的雙鏈斷裂（DSB）。在識(shí)別該途徑的功能后不久，來自細(xì)菌化膿性鏈球菌（SpCas9）的II型CRISPR / Cas9系統(tǒng)被重新利用以產(chǎn)生簡(jiǎn)單但強(qiáng)大的分子工具，其可被編程以將核酸酶靶向特定的基因組序列。