熒光蛋白是如何發(fā)光的嗎？

熒光蛋白（FPs）于50多年前被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白（GFP），這是一種來(lái)自維多利亞水母的蛋白質(zhì)。自從發(fā)現(xiàn)以來(lái)，熒光蛋白家族不斷擴(kuò)大，有數(shù)百種變體可用。請(qǐng)繼續(xù)閱讀，以熟悉可用的FP發(fā)射顏色，并在為即將到來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇熒光蛋白（或兩個(gè)）時(shí)記住10點(diǎn)。

熒光是吸收光的物質(zhì)發(fā)射的光。發(fā)射的光的波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)。因此，F(xiàn)Ps是具有這種獨(dú)特能力的蛋白質(zhì)。

當(dāng)在大多數(shù)生物體中異位表達(dá)時(shí)，許多這些FP是熒光的。此外，將FP融合到另一種蛋白質(zhì)通常不會(huì)影響其熒光。因此，F(xiàn)P用于研究許多生物學(xué)問(wèn)題。兩個(gè)zui常見(jiàn)的用途是：1）測(cè)試特定系統(tǒng)中的表達(dá)水平（通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度）;2）可視化FP的定位（融合到感興趣的蛋白質(zhì)），從而跟蹤活細(xì)胞內(nèi)生物分子的定位。

熒光蛋白按發(fā)射顏色（發(fā)射波長(zhǎng)范圍）分類

熒光蛋白通常按發(fā)射顏色分類，如下所述（或發(fā)射波長(zhǎng)范圍）。通過(guò)突變GFP，衍生了藍(lán)色FP（BFP），青色FP（CFP）和黃色FP（YFP）的變體。有關(guān)GFP的細(xì)分，它是變體及其相關(guān)突變，請(qǐng)查看Marcy上周在GFP上的帖子。此外，在其他生物體中還發(fā)現(xiàn)了許多其他FP。

藍(lán):424 - 467  nm

青色: 474 - 492  nm

綠: 499 - 519 nm

黃色: 524 - 538  nm

橙: 559 - 572 nm

紅: 574 - 610 nm

遠(yuǎn)紅: 625 - 659 nm

紅外線: ≥ 670 nm

獨(dú)特的熒光蛋白類別

光活性/光轉(zhuǎn)換：當(dāng)這些蛋白質(zhì)被特定的激發(fā)波長(zhǎng)激活時(shí)，它們可以改變它們的顏色。這意味著發(fā)射波長(zhǎng)可以改變。在少數(shù)情況下，蛋白質(zhì)的初始狀態(tài)是非熒光的，因此允許非常低的背景水平的熒光。這種光可解或光可轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)的例子是PA-GFP，Dendra2和meEOS蛋白。一些蛋白質(zhì)是可逆可切換的（例如rsEGFP，Dreiklang）。

熒光定時(shí)器（FT）：這些蛋白質(zhì)會(huì)隨時(shí)間改變其顏色。因此，這些可以用作激活后細(xì)胞過(guò)程的“計(jì)時(shí)器”。四個(gè)主要的FT稱為慢FT，中FT，F(xiàn)ast-FT和mK-GO。

大斯托克斯位移（LSS）：斯托克斯位移（以George G. Stokes命名）是波長(zhǎng)從激發(fā)到發(fā)射的轉(zhuǎn)變。對(duì)于大多數(shù)FP，斯托克斯位移小于50nm（通常要小得多）。對(duì)于LSS蛋白，斯托克斯位移≥100nm。具體來(lái)說(shuō)，這些蛋白質(zhì)被紫外線或藍(lán)光激發(fā)，它們的發(fā)射是綠光或紅光。例如，T-Sapphire、LSSmOrange 和 LSSmKate。

熒光傳感器：這些FP會(huì)根據(jù)環(huán)境變化（例如pH，Ca）改變其激發(fā)/發(fā)射行為2+助焊劑等）。zui常用的是GECI - 遺傳編碼的鈣指示劑（例如GCaMP）。其他包括：pHluorin & pHTomato（pH傳感器），HyPer（H2O2傳感器）、ArcLight（電壓傳感器）和 iGluSnFr（谷氨酸傳感器）。這些生物傳感器的更多例子可以在Addgene上找到。

分裂FP - 一些FP（例如GFP，Venus）可以分成兩半，它們本身是非熒光的。如果兩半非常接近，它們將形成完整的FP和熒光。分裂FP可用于確定融合到分裂FP一半的兩種蛋白質(zhì)的接近程度。這種技術(shù)也被稱為雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）。

選擇熒光蛋白時(shí)要記住的8點(diǎn)

激勵(lì)和發(fā)射（ex/em）：

每個(gè)熒光蛋白都有其獨(dú)特的ex/em峰值。因此，請(qǐng)選擇系統(tǒng)可以激發(fā)的熒光蛋白，并檢測(cè)發(fā)射。例如，如果您的顯微鏡只有兩個(gè)激光器，分別為488nm和561nm，您將無(wú)法使用遠(yuǎn)紅熒光蛋白。如果您沒(méi)有將藍(lán)光傳遞到探測(cè)器/相機(jī)的過(guò)濾器，那么BFP對(duì)您毫無(wú)用處。

當(dāng)使用多個(gè)熒光蛋白時(shí)，請(qǐng)確保它們的發(fā)射光在波長(zhǎng)上不重疊。在許多顯微鏡中，濾光片不夠窄，無(wú)法區(qū)分密切相關(guān)的顏色。此外，大多數(shù)FP具有廣泛的發(fā)射范圍，可以通過(guò)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的濾光片檢測(cè)到（例如，GFP也發(fā)出黃光）。

請(qǐng)注意，F(xiàn)Ps的某些組合會(huì)導(dǎo)致稱為FRET（熒光[或F?rster]共振能量轉(zhuǎn)移）的效應(yīng)。當(dāng)來(lái)自一個(gè)FP（例如CFP）的能量轉(zhuǎn)移激發(fā)另一個(gè)FP（例如YFP）的熒光時(shí)，就會(huì)發(fā)生FRET。FRET僅在兩個(gè)FP之間的距離<10nm時(shí)發(fā)生，并且在標(biāo)記相互作用的蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)考慮。事實(shí)上，F(xiàn)RET通常用于確定兩種蛋白質(zhì)是否相互作用。

齊聚：代FP容易寡聚。這可能會(huì)影響FP融合蛋白的生物學(xué)功能。因此，建議使用單體FP（通常用“m”表示為蛋白質(zhì)名稱中的個(gè)字母，例如mCherry）。

氧：發(fā)色團(tuán)在許多FP（特別是來(lái)自GFP的FP）上的成熟需要氧氣。因此，這些FP不能在缺氧環(huán)境中使用。zui近，從鰻魚中分離出的一種新的GFP被證明可以獨(dú)立于氧氣成熟，適合在厭氧條件下使用。

成熟時(shí)間：成熟時(shí)間是FP正確折疊并產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)所需的時(shí)間。這可以從翻譯后的幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)。例如，超級(jí)文件夾GFP（sfGFP）和mNeonGFP可以在37°C下折疊<10分鐘，mCherry需要約15分鐘，TagRFP?100分鐘和DsRed?10小時(shí)。

溫度：FPs成熟時(shí)間和熒光強(qiáng)度會(huì)受到溫度的影響。例如，增強(qiáng)型GFP（EGFP）針對(duì)37°C進(jìn)行了優(yōu)化，因此zui適合哺乳動(dòng)物或細(xì)菌研究，而GFP不銹鋼更適合酵母研究（24-30°C）。

亮度：亮度是衡量發(fā)射亮度的指標(biāo)。亮度計(jì)算為蛋白質(zhì)的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率除以1000的乘積。在許多情況下，亮度與EGFP的亮度進(jìn)行比較，EGFP設(shè)置為1。一些蛋白質(zhì)非常暗淡（例如TagRFP657，其亮度為0.1），應(yīng)考慮到這一點(diǎn)。光穩(wěn)定性會(huì)受到實(shí)驗(yàn)參數(shù)（例如激發(fā)光強(qiáng)度、pH 或溫度）的影響。

光：熒光分子在長(zhǎng)時(shí)間暴露于激發(fā)光后被漂白（即失去發(fā)光的能力）。光穩(wěn)定性可以短至100ms（EBFP）或長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)（mAmetrine1.2）。但是，對(duì)于大多數(shù)FP，它是幾秒鐘到幾分鐘。光穩(wěn)定性可能受實(shí)驗(yàn)參數(shù)（例如激發(fā)光強(qiáng)度、pH 值或溫度）的影響。

pH 穩(wěn)定性：如果您計(jì)劃在酸性環(huán)境中表達(dá)FP（例如，微酸性酵母細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或突觸囊泡），則此參數(shù)很重要。一些FP具有不同的ex/em光譜（例如mKeima）或隨著pH值的變化而改變熒光強(qiáng)度（例如pHluorin，pHTomato）。

為什么選擇綠色熒光蛋白？

GFP是一種約27 kDa的蛋白質(zhì)，由來(lái)自維多利亞水母的238個(gè)氨基酸組成。它在可見(jiàn)光譜的綠色部分具有熒光發(fā)射波長(zhǎng)（因此得名），這是由于由蛋白質(zhì)中心（Ser65，Tyr66和Gly67）的三個(gè)特定氨基酸的成熟反應(yīng)形成的發(fā)色團(tuán)。當(dāng)被發(fā)現(xiàn)時(shí)，GFPzui令人驚訝的方面之一是發(fā)色團(tuán)自發(fā)形成，沒(méi)有額外的輔助因子，底物或酶活性 - 它只需要在成熟過(guò)程中存在氧氣。這意味著蛋白質(zhì)可以直接從維多利亞甲殼蟲中獲取，并在任何生物體中表達(dá)，同時(shí)仍然保持熒光。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)于1996年報(bào)道，是一種含有11 β片的“桶”形狀，發(fā)色團(tuán)隱藏在結(jié)構(gòu)的中心，不受水溶劑的淬火。這種緊密排列的結(jié)構(gòu)解釋了整個(gè)GFP蛋白的重要性，這幾乎完全是維持熒光活性所必需的;截?cái)嗍强梢匀萑痰?，但是，點(diǎn)突變是可以接受的。與當(dāng)時(shí)的傳統(tǒng)熒光染料相比，GFP的主要優(yōu)勢(shì)在于它是無(wú)毒的，可以在活細(xì)胞中表達(dá)，從而能夠研究動(dòng)態(tài)的生理過(guò)程。