分子雜交技術(shù)的原理

分子雜交指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA分子或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為分子探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

DNA分子變性：
DNA分子變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。
1、DNA分子變性的方法：①加熱；②改變DNA分子溶液的pH;③有機(jī)溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。
2、增色效應(yīng)：DNA分子在260nm處有zui大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時(shí)由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。利用DNA分子變性后波長(zhǎng)260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過程。
3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA分子變性，以溫度對(duì)紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。
4、融解溫度：通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度），由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，故又稱融點(diǎn)或融解溫度。因此Tm是指消光值上升到zui大消光值一半時(shí)的溫度。
5、影響Tm值的因素：Tm不是一個(gè)固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：
①外部因素：pH、離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。
②內(nèi)部因素：DNA分子的堿基比例、DNA分子的均一性；在相同條件下，DNA分子內(nèi)G-C配對(duì)含量高，其Tm值也高。

DNA分子復(fù)性：
變性DNA分子只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。
退火：通常DNA分子熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25～30℃左右時(shí)，變性后的單鏈DNA分子即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，這一過程又叫做退火。
復(fù)性后的DNA分子，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。倘若DNA分子熱變后快速冷卻，則不能復(fù)性。
影響復(fù)性速度的因素：
1、DNA分子濃度：愈高，復(fù)性速度也愈快。
2、DNA分子片段的大小：DNA分子片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，使DNA分子片段線狀單鏈互相發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的機(jī)會(huì)減少。因此，在復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)將DNA分子切成小片段，再進(jìn)行復(fù)性。
3、溫度：過高不利于復(fù)性。
4、溶液的離子強(qiáng)度：通常鹽濃度較高時(shí)，復(fù)性速度較快。
5、DNA分子順序的復(fù)雜性；簡(jiǎn)單的分子復(fù)性很快，如polyd和polyd由于彼此互補(bǔ)識(shí)別很快，故能迅速?gòu)?fù)性。但順序較復(fù)雜的DNA分子復(fù)性則較慢。因此通過變性速率的研究，可以了解DNA分子順序的復(fù)雜性。

分子雜交技術(shù)有哪些

分子雜交技術(shù)主要有三種：核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。
1、核酸分子雜交技術(shù)具有一定互補(bǔ)序列和核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對(duì)特定DNA或RNA序列進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。
2、聚合酶鏈反應(yīng)（即Polymerase chain reaction，PCR） 原理：PCR是模板DNA，引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸（dNTP）在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需目的DNA。包括三個(gè)基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈（變性）；在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)（退火）；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。
3、生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的分子生物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸分析檢測(cè)技術(shù)。zui初的生物芯片技術(shù)主要目標(biāo)是用于DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)譜鑒定和基因突變體檢測(cè)和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術(shù)。由于目前這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片、免疫芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術(shù)更符合發(fā)展趨勢(shì)。

分子雜交技術(shù)可按作用環(huán)境大致分為：液相雜交和固相雜交兩種類型。
1、液相雜交，液相雜交指所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相雜交是一種研究zui早且操作復(fù)合的雜交類型，在過去的30年里雖有時(shí)被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交分子探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。
2、固相雜交，固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條核酸鏈游離在溶液中。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA分子自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，故該法zui為常用。根據(jù)支持物的不同固相雜交又可為：濾膜雜交、菌落分子原位雜交和組織分子原位雜交。

分子雜交技術(shù)的應(yīng)用

1、核酸探針標(biāo)記編輯
核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針；根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否，可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況，可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法
2、雙鏈DNA探針標(biāo)記法編輯
分子生物研究中，zui常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。
3、單鏈DNA探針編輯
用雙鏈探針雜交檢測(cè)另一個(gè)遠(yuǎn)緣DNA時(shí)，探針序列與被檢測(cè)序列間有很多錯(cuò)配。而兩條探針互補(bǔ)鏈之間的配對(duì)卻十分穩(wěn)定，即形成自身的無效雜交，結(jié)果使檢測(cè)效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：
（1） 以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針；
（2） 以RNA為模板， 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。
4、寡核苷酸探針編輯
利用寡核苷酸探針可檢測(cè)到靶基因上單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種：?jiǎn)我灰阎蛄械墓押塑账崽结樅驮S多簡(jiǎn)并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫(kù)。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對(duì)，可以準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對(duì)序列雜交，對(duì)于一些未知序列的目的片段則無效。

分子雜交儀分類

分子雜交儀結(jié)構(gòu)和分類，上海峰志主要銷售美國(guó)UVP公司生產(chǎn)的HB-1000分子雜交箱。
分子雜交儀又被叫做分子雜交箱或者分子雜交爐，是通過核酸分子雜交技術(shù)對(duì)是否有已知基因序列存在于待測(cè)基因組中進(jìn)行檢測(cè)的設(shè)備。其在遺傳病的基因診斷、基因組中特定基因序列的檢測(cè)、酶切圖譜的制作和克隆基因的篩選等方面得到廣泛地應(yīng)用。

結(jié)構(gòu)
電腦控制系統(tǒng)、隔膜、雜交管、搖床、離心管轉(zhuǎn)架或雜交瓶轉(zhuǎn)架以及箱體共同構(gòu)成分子雜交儀，由于分子雜交儀的型號(hào)差異，其箱體所容納的平板數(shù)、載玻片數(shù)微孔版數(shù)、管子數(shù)也不一樣。

分類
根據(jù)自動(dòng)化程度，分子雜交儀包括全自動(dòng)分子雜交儀、半自動(dòng)分子雜交儀和普通分子雜交儀。
1.全自動(dòng)分子雜交儀
目前，全自動(dòng)分子雜交儀在基因芯片產(chǎn)品方面被使用，其能夠使雜交過程不需要人工參與，使整個(gè)雜交過程的自動(dòng)化得以實(shí)現(xiàn)。在特定溫度條件下，基因組DNA與芯片上特異的DNA探針發(fā)生反應(yīng)，然后進(jìn)行雜交、洗膜、孵育、顯色等，從而使檢測(cè)結(jié)果獲得，全自動(dòng)分子雜交儀(基因芯片雜交爐)自動(dòng)完成上述過程。
2.半自動(dòng)分子雜交儀
半自動(dòng)分子雜交儀不但可以控制雜交過程中的各種參數(shù)，而且還可以在人工參與下完成雜交后的如孵育、顯色等其他實(shí)驗(yàn)步驟。
3.普通分子雜交儀
普通分子雜交儀結(jié)構(gòu)通常為封閉式恒溫箱式，此外加上振蕩或旋轉(zhuǎn)式可動(dòng)機(jī)構(gòu)，溫度控制、轉(zhuǎn)速等實(shí)驗(yàn)參數(shù)的控制和調(diào)整由控制系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。

按照實(shí)驗(yàn)的需求，可以將分子雜交儀以下6類：
1. 微孔板原位雜交儀。
2. 載玻片原位雜交和平板雜交儀。
3.Western雜交儀。
4.用于大容量的分子雜交儀。
5.用于 Southern或者 Northern技術(shù)點(diǎn)雜交的雜交儀。
6. 用于小容量的核酸雜交儀。
7. 微孔板原位雜交儀。