北柴胡 (Bupleurum chinense DC.) 為傘形科柴胡屬植物,是 《中華人民共和國藥典》 (2010年版) 規定的藥用柴胡基源植物之一,以根入藥,具有解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣功效。主要藥效成分包括柴胡皂苷、揮發油、類黃酮和多糖等[1]。1977年Acketmann首先成功的用發根農桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) 侵染高等植物獲得毛狀根[2],人們就開始意識到毛狀根培養對于規模化生產和調控根部藥材藥效成分合成的廣闊前景。以往研究表明誘導產生的毛狀根不但具有生長迅速、次生代謝物質合成能力強的優點,而且生產能力穩定、不需外源激素,這些特點都有利于天然藥物的開發和利用[3, 4, 5]。目前,人參[6]、丹參[7]、桑樹[8]、高山紅景天[9]、新疆雪蓮[10]、長春花[11]、黃芩[12]等多種藥用植物建立了毛狀根誘導和培養體系,通過不同毛狀根根系篩選、培養條件優化等手段以獲得更高產量和藥效成分含量。發根農桿菌介導的藥用植物遺傳轉化已應用于植物次生代謝產物的生產[4]。利用Ri質粒,通過發根農桿菌介導的遺傳轉化,還可將外源基因導入誘導產生的毛狀根中[13, 14, 15, 16]。由此,可以通過轉化藥效成分合成與調控相關基因,在更廣尺度上建立更有價值的毛狀根培養體系。這一體系也是研究植物基因功能的有效手段[17, 18, 19, 20]。柴胡屬中高氏柴胡 (B. kaoi) 和三島柴胡 (B. falcatum) 的毛狀根誘導可見報道[21, 22],但未見毛狀根再生植株的報道。本研究從菌種種類、外殖體類型、侵染方式、侵染時間等多種毛狀根誘導條件出發,摸索誘導北柴胡毛狀根zui佳條件。隨后,對毛狀根再生植株培養條件進行了篩選,從而建立了穩定的柴胡毛狀根誘導和植株再生體系。為柴胡毛狀根的大規模培養和產業化開發奠定了基礎,也為柴胡次生代謝的基礎理論研究,如藥效成分生物合成關鍵酶基因、代謝調控基因的功能分析、性狀的基因改良等奠定了基礎。

材料與方法
菌株和植物材料
發根農桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) 菌株ACCC10060為中國中醫科學院中藥研究所崔光紅老師饋贈,菌株ATCC11325、A4和K599為大連工業大學張宗申老師饋贈,菌株R1601為實驗室劉小麗博士后保存。含有外源質粒的A4菌株的制備: 首先參考文獻[9]制備A4菌株感受態細胞,然后利用熱擊轉化法將質粒pK7GWIWG2D (II) (帶有綠色熒光蛋白GFP基因,購自比利時VIB生命科學研究所) 導入A4感受態細胞,于附加利福平和壯觀霉素的YEB[23]培養基上篩選,利用GFP特異引物PCR鑒定,選擇陽性克隆A4 (pK7GWIWG2D (II) )。植物材料為本課題組選育的北柴胡新品種“中柴2號”。

無菌苗培養
取“中柴2號”品種種子,自來水浸泡24 h,其間每間隔4 h換一次水,75% 乙醇浸泡15 min,無菌水沖洗3次,10﹪次氯酸鈉浸泡30 min,無菌水沖洗5～7次,無菌濾紙吸干表面水分,接種于無激素MS[23]固體培養基上,置于25 ℃條件下暗培養15天左右,種子開始萌發,轉入8 h/16 h光照和黑暗交替條件下培養1個月得到無菌苗。剪取幼苗根、葉片和葉基部,切成0.5～1 cm的切段,接種于愈傷誘導固體培養基 (MS + NAA 6 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1) 中,25 ℃暗培養,誘導愈傷組織形成。選取結實的愈傷組織接種于分化培養基 (MS + KT 0.5 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1) 中,分化成苗。愈傷組織可不斷繼代培養,因此可分批次誘導分化成苗,供后續毛狀根誘導用。

發根農桿菌活化
從 -80 ℃冰箱取出保存的菌種,劃線接種于含相應抗生素的YEB培養基上,28 ℃暗培養2天,挑取單菌落,于YEB液體培養基中 (添加相對應的抗生素) 28 ℃、180 r·min-1振蕩暗培養至OD600為1～1.2,再次按1∶100稀釋菌液后搖培OD600至0.6～0.8,5 000 r·min-1離心10 min,收集菌體,用等體積的B5液體培養基重懸菌體,供侵染用。

毛狀根誘導
剪取北柴胡無菌苗不同部位,包括葉片、葉基部、莖基部和根作為供侵染的外殖體,置于無激素B5培養基上預培養1～3天。選取發根農桿菌ACCC10060、ATCC11325、A4、K599和R1601作為本實驗供試菌種。將預培養的外殖體置于B5[24]培養基懸浮的菌液 [附加200 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)] 中浸染,分別采用物理劃傷處理、共搖培處理、超聲波處理和菌液浸泡的侵染方式,侵染時間設為15、20和25 min 3個梯度。侵染后的外殖體用無菌濾紙吸干表面多余菌液,轉入不同共培養固體培養基上,包括B5 + AS 200 μmol·L-1、MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1、B5和MS + NAA 6 mg·L-1,黑暗中共培養3天,在添加500 mg·L-1頭孢霉素的B5液體培養基中清洗后,用無菌濾紙吸干表面液體,轉入不同除菌固體培養基 (B5 + Cef 500 μmol·L-1和MS + NAA 6 mg·L-1 + Cef 500 μmol·L-1) 上,置于25 ℃暗室 中誘導發根。待發出的根長至2～3 cm,一部分直接轉入B5液體培養基中搖培; 另一部分將其切下轉接于B5 + 0.15 mg·L-1 IBA的固體培養基上培養4周 左右,選擇生長迅速、長2～3 cm的根切下,再轉入B5液體培養基,25 ℃、90 r·min-1暗培養。剪取北柴胡正常無菌苗的根,與毛狀根液體培養條件相同,做為對照。

毛狀根再生植株的獲得
將毛狀根液體培養時,產生的黃化小苗直接轉入固體MS基本培養基上,于光下培養即可成苗。另外毛狀根液體搖培時,產生的類愈傷組織,將其置于7種不同分化培養基 (表 1) 中進行篩選,誘導成苗。當小苗長至3～5 cm,移栽至基質 (蛭石∶沙土=1∶1),放入溫室,觀察生長情況。

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Table 1 List of media screened for plant regeneration from hairy root
毛狀根的檢測
根據文獻[24],合成引物rolC-F: 5'-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3'; rolC-R: 5'-TTAG TTCCATCTGCCCATCC-3',PCR擴增發根農桿菌Ri質粒上T-DNA所含有的rolC基因,證實是否獲得毛狀根; 根據質粒pK7GWIWG2D (II) 上GFP基因序列設計引物 (GFP-F: 5'-CGACGTAAACGGCCACA AGTTCAGCG-3'; GFP-R: 5'-GCCGTTCTTCTGCTT GTCGGCCATGATAT-3'),PCR擴增GFP基因,證實是否可將外源基因轉入毛狀根。引物均由上海生工 生物工程有限公司合成。取除菌完全毛狀根及其再 生植株和北柴胡試管苗及其正常根組織各約0.1 g,用新型植物基因組DNA提取試劑盒 (TINAGEN公司) 提取DNA。PCR反應總體積25 μL,包括ddH2O 10 μL,Premix PrimeSTAR Hs 12.5 μL (TaKaRa公司),引物各0.5 μL (10 μmol·L-1),模板DNA 30 ng。PCR反應程序: ① 94 ℃預變性5 min; 98 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,40循環; zui后72 ℃延伸10 min; ② 94 ℃預變性5 min; 98 ℃ 15 s,66 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,30循環; zui后72 ℃延伸10 min。rolC基因擴增采用程序①,GFP基因擴增采用程序②。擴增產物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色,紫外燈下觀察。另外,將轉化質粒pK7GWIWG2D (II) 的發根農桿菌A4誘導的毛狀根及其再生植株,置于轉基因生物觀測鏡DFP-1 (Nightsea) 和Leica DM4000 B LED顯微鏡觀察。

結果與分析
1 毛狀根的誘導和培養
發根農桿菌A4、R1601、ATCC11325、ACCC10060均可誘導出毛狀根,其中發根農桿菌A4誘導發根率顯著高于其他3種,約10% 左右,zui低的是ATCC11325,500個外殖體中只有一個發根。將葉片、葉基部、莖基部和根4種不同外殖體用同種菌液同樣條件誘導毛狀根,結果顯示葉基部的誘導率zui高,葉片次之。另 外,外殖體的大小也影響誘導成功率,長1～1.5 cm、寬0.5 cm的誘導成功率較高,體積過小的外殖體更容易被菌液或抗生素殺死而不會誘導出毛狀根。以物理劃傷處理、共搖培處理、超聲波處理、菌液浸泡4種不同的侵染方法在相同誘導條件下誘導北柴胡毛狀根,結果顯示只有菌液浸泡的方法有效。不同侵染時間也對誘導率有一定的影響,設置15、20、25 min 3種不同的侵染時間,其中20 min侵染時效果zui佳; 25 min侵染時,后續除菌困難,外殖體褐化嚴重。

外殖體除菌培養10天后出現發根現象。在B5 + AS 200 μmol·L-1、MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1、B5、MS + NAA 6 mg·L-1 4種共培養基條件下誘導北柴胡毛狀根,結果顯示共培養時添加乙酰丁香酮的誘導率較高。另外,在B5 + AS 200 μmol·L-1條件下,葉片基部直接發根,每個葉片基部通常發出一條或幾條根 (圖 1-a、b),經rolC基因擴增證實,如此發出的根通常均為毛狀根。MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1條件下,先在葉片表面長出愈傷,而后通過愈傷發出較多條根 (圖 1-c),rolC基因擴增證實,其中有不定根,也有毛狀根。

待外殖體上發出的根長至3 cm左右,一部分直接移入無激素B5液體培養基培養,但生長緩慢,直至培養12周后,毛狀根才大量生長 (如圖 1-f)。因此將另一部分外殖體上發出的根剪取下來移至B5 + IBA 0.15 mol·L-1培養基上,培養至2周,毛狀根分出許多側根 (如圖 1-d),然后將其移入無激素B5液體培養基培養,培養6周后 (如圖 1-e),毛狀根大量生長。有些外殖體發出的根,尤其是通過愈傷發出的根,從外殖體上剪下置于無激素培養基上培養時,開始褐化,不再繼續生長,也不能產生側根,應為不定根。

綜合北柴胡誘導毛狀根的zui佳條件為: 發根農桿菌A4侵染北柴胡無菌苗葉基部,使用菌液浸泡方法侵染20 min,置于B5 + AS 200 μmol·L-1或MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1上共培養3天,再轉入添加除菌劑的同樣培養基上誘導發根,發出的根先在有激素培養基上短期培養后,再轉入無激素培養液內大量搖培。

2 毛狀根的植株再生
誘導產生的毛狀根在液體搖培階段伴隨脫落現象,有些毛狀根根系脫落類似愈傷的組織小塊,繼續在液體中培養,毛狀根本身會表現出生長緩慢、且逐漸老化的現象 (圖 2-a、b)。將脫落下的類愈傷組織,置于固體培養基上誘導成苗,共設置了7種含有不同激素的培養基進行篩選。結果7種培養基均可使類愈傷組織再生成苗,其中5號培養基生成的幼苗生長狀態zui佳 (圖 2-c)。將生成的再生幼苗轉置MS基本培養基中繼續培養。培養過程中,在幼苗的根莖部位還可出現分化芽 (圖 2-d),不定芽仍可繼續長成完整植株,由此得到大量毛狀根再生植株。另外還有些毛狀根根系直接脫落幼苗,由于液體搖培是處于黑暗中,小葉片黃白色 (圖 2-e、f),將其轉入固體MS基本培養基上,置于光下培養,白化幼苗繼續生長,葉片轉為綠色。幼苗長到一定大小后,其根上又會脫落下小幼苗,先是長出小側根,隨后在側根與主根接合處側根基部長出兩片小葉片 (圖 2-g)。將再生植株移栽至基質 (蛭石-沙土=1∶1) 中,再生植株可正常生長,與正常播種的種子植株沒有明顯差別。另外,將再生植株的根剪下放入無激素液體B5培養基中搖培,仍可大量發根,表現出典型的毛狀根特性。

3 柴胡毛狀根rolC基因和再生植株GFP基因PCR檢測及GFP綠色熒光檢測
取A4 (pK7GWIWG2D (II) ) 誘導產生的毛狀根及其再生植株提取基因組DNA,分別進行rolC基因和GFP基因的PCR擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得預期條帶,經測序驗證為rolC基因序列 (圖 3) 和GFP基因序列 (圖 4)。證實獲得了毛狀根,而且外源基因也已成功整合到柴胡基因組中。另外,使用轉基因生物觀測鏡觀察到了由葉片上誘導發出的帶綠色熒光的毛狀根 (圖 5-b)。利用顯微鏡也觀察到了毛狀根再生植株的葉片和根中的綠色熒光 (圖 5-i、k)。

討論
發根農桿菌誘導產生毛狀根及其植株再生體系已在多種植物中得到研究。但是,不同植物誘導條件和植株再生條件都有很大差別,有些植物的發根難以誘導,對于每種植物的誘導條件沒有固定模式可循,需要針對研究的植物嘗試摸索出適宜的誘導培養條件[3, 4, 5]。北柴胡毛狀根誘導和植株再生體系還未見報道。與北柴胡同屬的其他種,如臺灣產高氏柴胡 (B. kaoi) 和韓國三島柴胡 (B. falcatum) 的毛狀根研究有報道[21, 22],但未見柴胡毛狀根再生植株的報道。三島柴胡毛狀根誘導采用A4菌株,但具體誘導率等情況未見詳細報道。高氏柴胡毛狀根誘導是將葉片 基部于無激素B5培養基上預培養5天,采用R1601侵染5 min后共培養3天,再進行除菌培養,獲得毛狀根[21]。本實驗也采用了R1601,但誘導率不及A4。與高氏柴胡研究結果一致的是葉片基部較其他部位如葉片、莖等更容易發根。本實驗從菌株種類、外殖體種類、侵染方式、侵染時間和共培養培養基種類等誘導條件出發,篩選到了能夠誘導北柴胡毛狀根形成的綜合條件,但誘導率在10% 左右。高氏柴胡毛

狀根誘導研究中對影響毛狀根誘導和培養的各種因素進行了細致比較,結果顯示盡管采用根和莖基部為外殖體時,發根率可達80% 以上,但是未經農桿菌侵染的對照也可形成近 的發根,表明如此發出的根絕大部分可能為不定根,從中鑒定篩選出毛狀根較為困難。所以不建議使用根和莖基部作為柴胡 毛狀根誘導的外殖體。除此之外,高氏柴胡毛狀根誘導率與本研究中北柴胡毛狀根誘導率基本一致,也在10% 左右。相比其他植物毛狀根誘導率,有些可達60% 左右[7, 21, 22],也有些毛狀根誘導難以成功[25],柴胡毛狀根誘導率是否還可提高有待繼續從菌株和誘導條件等方面摸索。柴胡毛狀根的規模化生產條件也還需要進一步探索研究。另外,實驗中獲得了轉化有外源GFP基因的毛狀根再生植株,這一體系將應用于柴胡重要基因的功能研究。

孫晶1,2, 徐潔森1,3, 趙立子1,3, 魏建和1,3, 楊洪一2, 隋春1,3通訊作者 cscui@implad.ac.cn   
1. 中國醫學科學院、北京協和醫學院藥用植物研究所, 北京 100193;
2. 東北林業大學生命科學院, 黑龍江 哈爾濱 150040;
3. 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室, 北京 100193